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Funktionelle Genomik der vaskulären Schäden bei Hypertonie

 


Prof. Dr. Thomas Unger

Teilprojektleiter

 

Prof. Dr. Thomas Unger

 

Charite; Universitätsmedizin Berlin / Campus Mitte

Center for Cardiovascular Research

Hessische Str. 3-4

10115 Berlin

email:  thomas.unger@charite.de

Tel:       030-450 525 001

 

 

 

 


Im Rahmen dieses Projekts werden die molekularen Mechanismen vaskulärer Schäden bei Hypertension untersucht. Derzeit untersuchen wir die die Rolle der Signaltransduktion G-protein vermittelter Rezeptoren (GPCRs) und Steroidrezeptoren im Gefäßsystem mit genetisch veränderten Mausmodellen. Die normale kardiovaskuläre Entwicklung und Physiologie hängt z.T. von der Signaltransduktion, die durch die GPCRs vermittelt wird, wie z.B. der Angiotensin II Typ 1 Rezeptoren, der Sphingosin-1-Phosphat und Endothelin-1 Rezeptoren, ab. RGS (Regulator of G-protein signaling) Proteine sind GTPase regulierende Proteine, die das Signal über heteromere G-Proteine abschwächen. Eine Abschwächung der RGS2-Expression kann u.U. die Entwicklung eines Bluthochdruckes begünstigen. Daher erfordert die pathophysiologische Rolle dieses Proteins eine tiefer gehende Analyse. Zusätzlich zu den GPCRs sind Mineralkortikoide und der Mineralkortikoidrezeptor (MR) in die Regulation des Blutdrucks involviert. Die Funktion des MR bei verschiedenen Zellen und Geweben der Maus wird mittels der Cre/loxP Technologie untersucht. Ein drittes Projekt untersucht die molekularen Mechanismen der Bildung von Aortenaneurysmen, die eine häufige Komplikation bei lang andauernd bestehendem Hochdruck des Gefäßsystems darstellen. Die hier beschriebene Analyse konzentriert sich auf die Rolle Kallikrein-Kinin-Systems und Renin-Angiotensin-Systems im vaskulären „remodelling“.

 

 

Thema 1

Systemische Hämodynamik in RGS-2 defizienten Mäusen: Die Rolle g-Protein gekoppelter Rezeptoren bei der Kurz- und Langzeitregulation des Blutdruckes und der kardiovaskulären Endorganschädigung.

RGS2 Deletion in Mäusen verlängert das durch g-Protein Rezeptoren vermittelte vasokonstringierende Signal und erhöht dadurch den Blutdruck; nichtsdestotrotz bleiben viele Unklarheiten über die Blutdruckregulation angesichts der RGS2 Defizienz.

 

 



Abb.1: Veränderungen im mittleren arteriellen Blutdruck ( MAP) nach 1,2 und 3 mg/kg Prazosin in RGS2-/- und RGS2+/+ Mäusen. Der stärkere Blutdruckabfall während 1-adrenerger Rezeptorblockade mit Prazosin (1mg/kg) weist auf eine höhere sympathische Aktivität bei diesen Mäusen hin. Bei den höheren dosen war der Unterschied weniger ausgeprägt. $: p


Abb.1: Veränderungen im mittleren arteriellen Blutdruck ( MAP) nach 1,2 und 3 mg/kg Prazosin in RGS2-/- und RGS2+/+ Mäusen. Der stärkere Blutdruckabfall während 1-adrenerger Rezeptorblockade mit Prazosin (1mg/kg) weist auf eine höhere sympathische Aktivität bei diesen Mäusen hin. Bei den höheren dosen war der Unterschied weniger ausgeprägt. $: p<0.05 Grundwert vd. Prazosin (steady state; 40 bis 60 min. nach Injektion) *:p<0.05.



Wir haben die Funktion des autonomen Nervensystems und der Blutdruckregulation in RGS2 defizienten (RGS2-/-) Mäusen untersucht. Wir haben im Einzelnen den arteriellen Blutdruck und die HF mit Hilfe von Telemetrie gemessen. Wir haben „frequency domain“ Messungen der Blutdruck- und Herzfrequenzvariabilität (HRV) aufgezeichnet, ebenso wie die Sensitivität des Barorefexes (BRS-LF), die umweltbedingte Stress-Sensitivität und die Katecholamin-Exkretion im Urin untersucht.

 

 



Abb.2: Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP) und Herzfrequenz (HR) zeigten einen klar umrissenen Tag / Nacht Rhythmus in beiden Stämmen. In RGS2-/- Mäusen stieg der MAP um 10mm HG an, während die HR unverändert blieb. Dies weist auf einen „reset“ des Barorezeptor Reflexes hin (*p


Abb.2: Mittlerer arterieller Blutdruck (MAP) und Herzfrequenz (HR) zeigten einen klar umrissenen Tag / Nacht Rhythmus in beiden Stämmen. In RGS2-/- Mäusen stieg der MAP um 10mm HG an, während die HR unverändert blieb. Dies weist auf einen „reset“ des Barorezeptor Reflexes hin (*p<0.05).



Wir schließen daraus, dass die RGS2 Deletion einen Anstieg des sympathischen Tonus und der Stress-Sensitivität bewirkt und einen „Reset“ des Barorezeptor-Herzfrequenz-Reflexes bewirkt, während die Empfindlichkeit des Barorezeptors unverändert bleibt.

 

 

Thema 2

Rolle des vaskulären Mineralkortikoidrezeptors bei der Blutdruckregulation und der Endorganschädigung.

Man weiß, dass Mineralkortikoide und der Mineralkortikoidrezeptor (MR) in die Blutdruckregulation involviert sind. Wir konnten kürzlich zeigen, dass Aldosteron die durch Angiotensin (Ang) II induzierte Aktivierung der MAP Kinase potenziert (Mazak 2004). Interessanterweise wurde die durch Angiotensin II – induzierte ERK ½ Phosphorylierung durch den MR Blocker Spironolakton inhibiert (Spi, Abb. 3).

 

 



Abb. 3 Ang II induzierte ERK Phosphorylierung hängt vom MR Blocker Spironolakton (Spi) ab.

Abb. 3



Zur Analyse des MR in glatten Gefäßmuskelzellen haben wir begonnen, den Blutdruck in VSMC Mutanten zu analysieren und die vaskuläre Reaktion auf Aldosteron zu messen. Diese Messungen werden in Kooperation mit Prof. Luft in Berlin durchgeführt. Um ein besseres Verständnis der Rolle des Steroidhormonrezeptors bei der Gefäßfunktion zu erreichen, kombinieren wir zwei Strategien und Prozeduren, die wir in unserem Labor entwickelt haben: hochspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System (Abb. 4) und BAC transgenes sowie Genexpressionsprofiling mit Amplifikation von RNA im Nanogramm Bereich.

 

 



Abb. 4 Tamoxifen induzierte Cre Aktivität in SMMHC-iCreERT2 Mäusen (ROSAlacZ Reporter).


Abb. 4



Mithilfe der ausgereiften Affymetrix Technologie zur systematischen Genexpressionsanalyse haben wir begonnen, das Profil der Genexpression in ausgewählten Zielzellen zu untersuchen. Zusätzlich konnten wir ein lentivirales Vektorsystem zur Expression von RNAi entwickeln. Mit dieser Technologie werden wir in Kürze in der Lage sein, dieses vielversprechende System zur schnellen molekulargenetischen Definition der Funktion von Zielgenen zu nutzen, die beim Screening identifiziert worden sind. Kandidatengene werden darüber hinaus in Kooperation mit dem MPI in Berlin (M. Janitz/ H. Lehrach, Berlin) untersucht. Diese NGFN-Plattform stellt eine etablierte Methode funktioneller Hochdurchsatz Charakterisierung von Genen zur Verfügung, die auf existierenden Verfahren bei dem Zellen mit Mikroarrays immobilisierter DNA auf Glasplättchen transfiziert werden, dem so genannten „transfected cell array“ (TSA). TSA stellt einen Hochdurchsatz Tool für die funktionelle Genanalyse in Gefäßzellen dar. Wir wollen dieses System in verschiedenen Zelllinien und Zelltypen zur Erstellung einer funktioneller Signatur individuelle Gene, die in die Signaltransduktion des Mineralkortikoidrezeptors im Gefäßsystem involviert sind sowie für das gesamt Projekt CV1.3 einsetzen.

 

 

Thema 3

Molekulare Signalwege bei der Bildung abdominaler Aortenaneurysmen

Man weiß, dass das Kallikrein-Kinik und das Renin-Angiotensin System eine wichtige rolle beim hämodynamischen Stress spielt, der als ursächlicher Faktor für die aneurysmenbildung erkannt wurde. Durch Vergleich von Brown Norway Ratten (BN) genetisch bedingten kiniogen-defizienten Brown Norway Katholik (BN/Ka) Ratten konnten wir kürzlich zeigen, dass eine kinikogen-Defizienz die Formation abdominaler Aortenaneurysmen, aber nicht die Atherosklerose, begünstigt (Kaschina et al. 2004, Abb. 5).  Wir haben das Gewebe humaner abdominaler Aortenaneurysmen untersucht und fanden eine aktivierung von Matrix Metalloproteinasen, Cystinproteasen und konponenten des Renin-Angiotensin Systems (Cathepsin D, Chymase, AT1 Rezeptor) ebenso wie eine down-Regulierung des antiproteolytischen Mediators ((TIMP-4 und hochmolekulares Kininogen). Mit Hilfe primärer Zellkulturen (VSMC, EC) konnten wir zeigen, dass doppelsträngiges hochmolekulares Kininogen die durch interleukin-1 alpha in VSMC induzierte MMP-2 Expression abschwächte und dadurch apoptosehemmend wirkte. Weitere Analysen des primären intrazellulären Signalweges durch ein zelluläres Transfektions - Array werden in Kooperation mit dem MPI-MG (M. Janitz) durchgeführt.  

 

Um die maßgeblichen Prozesse beim „Remodelling“ der Aorta zu untersuchen, haben wir die Expressionsprofile von Geweben chirurgisch behandelter Patienten mit atherosklerotischem Aortengewebe verglichen (Kooperation mit C. Maercker, RZPD). Aufgrund der ergebnisse werden neue therapeutische Strategien bei unseren Ratten angewendet.

 

 



Abb. 5 Abdominale Aortenaneurysmen bei verschiedenen Rattenstämmen: Männliche Ratten, 22 Wochen alt, nach 12 Wochen atherogener Diät. Abdominale Aorta,: Querschnitt, Weigert Färbung,  Sirius rot Pikrin Färbung.


Abb. 5 Abdominale Aortenaneurysmen bei verschiedenen Rattenstämmen: Männliche Ratten, 22 Wochen alt, nach 12 Wochen atherogener Diät. Abdominale Aorta,: Querschnitt, Weigert Färbung, Sirius rot Pikrin Färbung.



Das übergeordnete Ziel dieses Subprojektes ist, neue Erkenntnisse über die Genomik des Gefäßtonus und das vaskuläre „Remodeling“ bei Hypertonie zu gewinnen. Anstieg des vaskulären Tonus und vaskuläre Schäden sind die hauptsächlichen Faktoren bei der Progression der Hypertonie und der Endorganschäden, insbesondere bei Schlaganfall und bei der koronaren Herzerkrankung. In diesem Zusammenhang stellen wir Tiermodelle als eine Ressource für andere Netzmitglieder zur Validierung von Kandidatengenen bei vaskulären Erkrankungen Verfügung.

 

 



Arbeitsgruppe Prof. Unger

Arbeitsgruppe Prof. Unger



Referenzen:

 

1.    Kaschina E, Stoll M, Sommerfeld M, Steckelings UM, Kreutz R, Unger T. Genetic kininogen deficiency contributes to aortic aneurysm formation but not to atherosclerosis. Physiol Genomics. 2004 Sep 16;19(1):41-9.

 

2.    Otto C, Hein L, Brede M, Jahns R, Engelhardt S, Grone HJ, Schutz G. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 2004 Nov 16;110(20):3245-51.

 

3.   Mazak I et al., Aldosterone potentiates angiotensin II-induced signaling in vascular smooth muscle cells.  Circulation 2004;109:2792-2800. 2. Kaschina E et al., Genetic kininogen deficiency contributes to aneurysm formation but not to  atherosclerosis. Physiol Genomics, 2004;19:41-49

 

4.    Obst M, Gross V, Luft FC. Systemic hemodynamics in non-anesthetized L-NAME- and DOCA-salt-treated mice. J Hypertens. 2004 Oct;22(10):1889-94.

 

5.    Gross V, Obst M, Luft FC. Insights into angiotensin II receptor function through AT2 receptor knockout mice. Acta Physiol Scand. 2004 Aug;181(4):487-94.

 

6.    Bachmann S, Mutig K, Bates J, Welker P, Geist B, Gross V, Luft FC, Alenina N, Bader M, Thiele BJ, Prasadan K, Raffi HS, Kumar S. Renal effects of Tamm-Horsfall protein (uromodulin) deficiency in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 2005 Mar;288(3):F559-67.

 

7.    Gross V, Tank J, Obst M, Plehm R, Blumer KJ, Diedrich A, Jordan J, Luft FC. Autonomic nervous system and blood pressure regulation in RGS2-deficient mice Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2005 May;288(5):R1134-42.

 

 


Informationen zum Klinikum finden Sie unter:

http://www.ccr.charite.de/ungerP.php

 

 


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